Изменения состава конденсата выдыхаемого воздуха у курильщиков

Цель. Установление влияния курения в зависимости от стажа на концентрацию ионов аммония, нитритов в конденсате выдыхаемого воздуха, а также на его кислотность в сравнении с показателями здоровых некурящих людей. Выявить потенциальные маркеры хронического бронхита курильщика.

Материал и методы. Проведено исследование  конденсата выдыхаемого воздуха в двух группах курильщиков с различным стажем и в группе некурящих людей. Концентрацию нитритов измеряли по методу Грисса, аммония —  с помощью метода Несслера,  pH — потенциометрическим методом на иономере при помощи микронасадки. Для статистической обработки данных использовали непараметрические методы Манна—Уитни, Спирмена и критерий Уилкоксона.

Результаты. Положительная корреляция между показателем рН и концентрацией иона аммония отсутствовала у курящих со стажем более 15 лет, имевших в анамнезе хронический бронхит. У этих же курильщиков выявлено защелачивание бронхоальвеолярной жидкости по сравнению с нормой. Концентрация аммония сопоставима с уровнем аммония у молодых курильщиков после 5-минутного отказа от курения. Уровень нитритов превышал норму в 3 раза.

Заключение. Манифестными маркерами хронического бронхита курильщика можно считать уровень нитритов и защелачивание конденсата выдыхаемого воздуха по сравнению с нормой.

Курение на сегодняшний день остается одним из наиболее значимых факторов риска развития заболеваний дыхательной и сердечно-сосудистой системы. В настоящее время в клиническую практику наравне с традиционными способами (биопсия, бронхоальвеолярный лаваж, индуцированная мокрота) начинает активно внедряться новый перспективный экспресс-метод диагностики воспалительных и окислительных процессов в дыхательной системе — исследование конденсата выдыхаемого воздуха (КВВ). Данный метод неинвазивен, прост, безопасен, доступен для пациентов любого возраста и при любой степени тяжести легочной патологии и адекватно отражает изменения в дыхательной системе при различных состояниях.

Данная работа является продолжением предыдущего исследования КВВ, проведенного в 2007— 2008 гг., у курильщиков с малым стажем [1]. Цель представленного исследования — установление влияния длительного стажа курения на концентрацию NH4+, нитритов в КВВ, а также на его кислотность в сравнении с аналогичными показателями здоровых некурящих людей, а также выявление потенциальных маркеров хронического бронхита курильщика в КВВ.

О выраженности окислительного стресса в дыхательной системе можно судить по количеству метаболитов монооксида азота (NO), прооксиданта, формирующего пероксинитриты. Они участвуют в перекисном окислении липидов, вступают в связь с тиолсодержащими биомолекулами (цистеин, глутатион), образуя
S-нитротиолы, или окисляются до нитритов и нитратов [2]. При исследовании продуктов обмена азота в КВВ оценивали баланс между нитритами/нитратами, S-нитротиолами в бронхоальвеолярной жидкости (БАЖ). Обнаружено значительное повышение концентрации NO-метаболитов в КВВ у курильщиков, при бронхиальной астме (БА), бронхоэктатической болезни, муковисцидозе [3—6]. Продукция нитритов и нитратов из NO,  активных форм кислорода является pH-зависимым процессом [7]. Наиболее изучен глутаминазный механизм поддержания кислотно-основного состояния БАЖ за счет образования ионов аммония [7]. Провоспалительные цитокины нарушают механизм образования NH4+ практически при всех патологических состояниях, сопровождающихся воспалением [7—9]. Содержание NH4+ в КВВ повышается при хроническом бронхите по мере утяжеления заболевания [10] и понижается при БА [7].

М а т е р и а л  и  м е т о д ы
В исследовании принимали участие 20 мужчин-добровольцев в возрасте от 35 лет до 61 года, курильщики со стажем от 15 до 30 лет, среднее количество выкуриваемых в сутки сигарет с фильтром составляло 20 штук. У всех обследованных диагностирован хронический бронхит. Сбор КВВ проводили с помощью стеклянного конденсора, действие которого основано на принципе противотока. Для устранения влияния факторов внешней среды исследование осуществляли в помещении с постоянной температурой 18—23°С и относительно постоянной влажностью. Обследованные дышали с частотой 18 дыхательных актов/мин в течение 25 мин. В исследовании не использовали клипсы для носа, способствующие попаданию в конденсат примесей из полости носа. Для охлаждения конденсор погружали в емкость с тающим льдом. Собранный конденсат до исследования замораживали при -18°С в холодильной камере.

Концентрацию нитритов измеряли по методу Грисса с использованием сухого порошка реактива Грисса (Sigma Chemical) [11]. Образующийся азокраситель имеет оптическую плотность в видимой и ультрафиолетовой части спектра, пропорциональную концентрации нитрит-ионов. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре (СФ-46, Ломо, Россия) при длине волны 540 нм. Экстинкцию оценивали по калибровочной кривой, которую строили по стандартным растворам NaNO2 10 — 500 мкмоль/л.

Абсолютная погрешность метода составила 0,5 мкмоль/л.

Аммоний реагирует в щелочной среде с реактивом Несслера (тетраиодомеркуриат (II) калия) (Уральский завод химических реактивов, Россия), образуя осадок желто-коричневого цвета. Интенсивность окраски оценивали спектрофотометрически при длине волны, равной 410 нм, экстинкцию — по калибровочной кривой, которую строили по стандартным растворам NH4Cl — 0,1—10 мкмоль/л. Предел чувствительности метода составил 0,2 мкмоль/л, абсолютная погрешность — 0,03 мкмоль/л.
pH измеряли на иономере И-160 (ЗИП, Гомель) при помощи микронасадки. Абсолютная погрешность метода составила 0,005.

Распределение изучаемых показателей отличалось от нормального. Для статистической обработки использовали метод Манна—Уитни для сравнения независимых выборок и метод Спирмена для исследования связи двух признаков. Данные представлены как медиана и 50-процентный интерквартильный интервал. Статистическую обработку проводили с использованием программного приложения STATISTICA 6.0 и Microsoft Excel 2003.

Полученные результаты сравнивали с данными предыдущего исследования в двух группах добровольцев в возрасте от 18 до 23 лет: 1-я группа — некурящие (10 мужчин, 10 женщин), 2-я группа  — курящие (15 мужчин, 5 женщин), средний стаж курения 3,5 года [1]. Все лица, вошедшие в исследование, на момент сбора КВВ были здоровы. Сбор КВВ в группе курящих проводили дважды: 1-й раз через 5 мин после курения, 2-й  — после 12-часового воздержания от курения.

Р е з у л ь т а т ы  и  о б с у ж д е н и е
У курильщиков со стажем свыше 15 лет выявлено защелачивание БАЖ по сравнению с нормой. У курильщиков с небольшим стажем через 5 мин после курения отмечалось снижение pH по сравнению с некурящими. В случае 12-часового отказа от курения выявлено восстановление pH по сравнению с 5-минутным перерывом

Установлено, что у курящих со стажем свыше 15 лет диапазон концентраций аммония в КВВ соответствовал аналогичным  показателям у курильщиков  с небольшим стажем после 5-минутного перерыва между выкуриванием сигареты. При этом у последних через 5 мин после курения выявляли более чем двукратное снижение концентрации NH4+ по сравнению с некурящими. Через 12 ч после курения наблюдался подъем уровня аммония.

У курильщиков со стажем свыше 15 лет положительная корреляция между показателями pH и NH4+, отмеченная в группе некурящих и у курильщиков с небольшим стажем после 12-часового отказа от курения, отсутствовала.

В ходе исследования выявлено, что у привычных курильщиков диапазон концентраций нитритов превышал норму почти в 3 раза. Кроме того, у лиц с небольшим стажем отмечено повышение уровня нитритов через 5 мин после курения по сравнению с некурящими. Через 12 ч после курения происходило понижение концентрации нитритов по сравнению с аналогичными  показателями у тех же курильщиков через 5 мин после выкуривания сигареты, причем уровень понижался до нормы.

Выявленное почти трехкратное повышение уровня нитритов у курильщиков со стажем свыше 15 лет, а также отмеченное в предыдущем исследовании повышение уровня этого показателя у курильщиков с небольшим стажем через 5 мин после курения [1] соответствует литературным данным [6, 12—14]. Уже было  высказано предположение, что в механизме продукции нитритов при курении участвуют два механизма [1]:

1. В дыхательной системе NO образуется из L-аргинина при помощи NO-синтазы. Она существует в трех изоформах [15]. Одна из них, индуцируемая NO-синтаза (iNOS, NOS2), имеет намного большую по сравнению с другими изоформами активность. Она не зависит от концентрации внутриклеточного кальция, активируется провоспалительными цитокинами, эндотоксинами, вирусными частицами и отражает силу воспалительного процесса [16].

2. Растворение в БАЖ оксидов азота (II) и (IV), содержащихся в табачном дыме, что приводит к образованию как азотной и азотистой кислот, так и нитратов и нитритов.
Вероятно, со временем эффекты данных механизмов все больше куммулируются, что подтверждается уровнем нитритов у курильщиков со стажем свыше 15 лет.

Положительная корреляция между показателем рН и концентрацией иона аммония, отмеченная у некурящих и курильщиков с небольшим стажем после
12-часового отказа от курения и не прослеживающаяся у тех же людей непосредственно через 5 мин после выкуривания сигареты [1], также отсутствовала у курящих со стажем свыше 15 лет, имеющих в анамнезе хронический бронхит. Данный факт подтверждает выводы о нарушении при курении глутаминазного механизма поддержания кислотно-основного баланса БАЖ за счет образования ионов аммония [7]. В то же время Д. Л. Ивашкевич указывает на повышение уровня аммония у больных хроническим бронхитом по мере утяжеления заболевания  [10]. Вероятно, механизмы влияния на уровень аммония при развитии хронического бронхита в связи с курением и другими причинами отличаются, что ведет к нарушению глутаминазного механизма как при понижении концентрации аммония, так и при повышенном его уровне. Данный аспект требует дальнейшего детального изучения.

У курильщиков со стажем свыше 15 лет выявлено одновременное защелачивание БАЖ и снижение уровня аммония, при этом  положительная корреляция между данными показателями отсутствовала. В литературе объяснения данному факту не найдено. Это можно объяснить следующим.

1. У курильщиков с длительным стажем в процесс поддержания и восстановления кислотно-основного состояния в дыхательной системе при продолжительном воздействии сигаретного дыма на легочные ткани включаются иные, отличные от глутаминазного, механизмы компенсации. При длительном курении функцио¬нирование данных механизмов увеличено, что приводит к гиперэффектам.

2. У курильщиков со стажем свыше 15 лет в дыхательной системе синтезируются щелочные продукты для восстановления pH и компенсации нарушенных процессов регуляции, накопление которых с течением времени приводит к избыточному защелачиванию среды.

Автор статьи считает, что манифестными маркерами хронического бронхита курильщика можно считать уровень нитритов в КВВ и защелачивание БАЖ, однако это отличается от результатов других авторов [9, 10].

В ы в о д ы
1. Положительная корреляция  между показателем рН и концентрацией иона аммония отсутствует у курящих со стажем свыше 15 лет, имеющих в анамнезе хронический бронхит. Данный факт подтверждает выводы о нарушении при курении глутаминазного механизма поддержания кислотно-основного состояния БАЖ за счет образования ионов аммония [1].
2. У курящих со стажем свыше 15 лет выявлено защелачивание БАЖ по сравнению с аналогичными  показателями некурящих. Концентрация аммония сопоставима с  его уровнем у курильщиков с небольшим стажем после 5-минутного отказа от курения. Уровень нитритов превышает норму в 3 раза.
3. Манифестными маркерами хронического бронхита, развившегося на фоне длительного курения, можно считать уровень нитритов и защелачивание конденсата выдыхаемого воздуха по сравнению с нормой.

Л И Т Е Р А Т У Р А
1. Мельников С. И., Ольшевский А. А. // Здравоохранение.— 2009.— № 1.— С. 19—21.
2. Mathews W. R., Kerr S. W. // J. Pharmacol. Exp. Ther.— 1993.— Vol. 267, № 3.— P. 1529—1537.
3. Corradi M. et al. // Nitric Oxide.— 2003.— Vol. 8, № 1.—
P. 26—30.
4. Balint B. et al. // Thorax.— 2001.— Vol. 56, № 6.— P. 456—461.
5. Garey K. W. et al. // Chest.— 2004.— Vol. 125, № 1.— P. 22—26.
6. Смирнов А. С. // Мед. журн.— 2006.— № 2.— С. 90—92.
7. Hunt J. F. et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med.— 2000.— Vol. 161, № 3 (Pt 1).— P. 694—699.
8. Horvath I. et al. // Eur. Respir. J.— 2005.— Vol. 26, № 3.—
P. 523—548.
9. Gessner C. et al. // Respir. Med.— 2003.— Vol. 97, № 11.— P. 1188—1194.
10. Ивашкевич Д. Л. // Мед. новости.— 2001.— № 3.— С. 64—66.
11. Green L. G. et al. // Anal. Biochem.— 1982.— Vol. 126, № 1.— P. 131—138.
12. Chambers D. C. et al. // Thorax.— 1998.— Vol. 53. —
P. 677—679.
13. Kharitonov S. A. et al. // Am. J. Respir. Crit. Care Med.— 1995.— Vol. 152.— P. 609—612.
14. Klebanoff S. J. // Free Radic. Biol. Med.— 1993.— № 4.—
P. 351—360.
15. Nathan C., Xie Q. W. // J. Biol. Chem.— 1994.— Vol. 269, № 19.— P. 13725—13728.
16. Barnes P. J., Belvisi M. G. // Thorax.— 1993.— Vol. 48, № 10.— P. 1034—1043.

Поступила 20.04.09.

Ключевые слова: , , , , , , , ,
Автор(ы): Мельников С. И.
Медучреждение: Белорусский государственный медицинский университет