Перейти к основному содержанию

Научно-практический рецензируемый ежемеcячный журнал. Орган Министерства здравоохранения Республики Беларусь
Входит в Перечень научных изданий Республики Беларусь для опубликования результатов диссертационных исследований по медицинским и биологическим наукам. Журнал включен в систему Российского научного цитирования.
Журнал издается с 1924 года.

Получение и характеристика рекомбинантного полипептида нуклеокапсидного белка вируса Марбург

It appears your Web browser is not configured to display PDF files. Download adobe Acrobat or click here to download the PDF file.

Click here to download the PDF file.

Цель исследования. Клонирование, экспрессия в прокариотическои системе и характеристика рекомбинантного полипептида, представляющего антигензначимыи участок нуклеокапсидного белка вируса Марбург.

Материал и методы. В качестве исходного материала в работе использован вирус Марбург, штамм Voege, полученный из специализированной коллекции вирусов и бактерии, патогенных для человека, РНПЦ эпидемиологии и микробиологии. Для экспрессии рекомбинантного белка использовали бактериальный штамм Е. coli BL21 (DE3). Использованы стандартные генно-инженерные, молекулярно-биологические и серологические методы исследования.

Результаты. С использованием генно-инженерных методов исследования получена гибридная векторная конструкция pJC40/NP MAR, обеспечивающая экспрессию рекомбинантного полипептида вируса Марбург в прокариотическои системе Е. coli, штамм BL 21 (DE3). Показана возможность использования высокоочищенного рекомбинантного полипептида для выявления специфических антител к вирусу Марбург методом иммунного блоттинга.

Заключение. Сконструирована плазмида pJC40/NP MAR, в прокариотическои системе Е. coli экспрессирован рекомбинантныи полипептид, представляющии антигензначимыи участок нуклеокапсидного белка вируса Марбург. Получен очищенныи рекомбинантныи полипептид вируса Марбург, не содержащии примесеи бактериальных белков, обладающии антигенными своиствами.

Развитие международных интеграционных и экономических процессов, межэтнические и культурные контакты, миграционные потоки населения в силу экологических или экономических факторов приводят к возникновению новых или расширению ареалов известных опасных и особо опасных природно-очаговых инфекционных заболеваний.

Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний представляет собой важное звено системы здравоохранения. Профилактика и лечение любого заболевания значительно облегчается ранней и точной идентификацией вызвавшего его патогенного микроорганизма. Одним из основных путей создания эффективных диагностических препаратов для выявления возбудителей инфекционных заболеваний является серодиагностика, основанная на аффинном взаимодействии антигенов и вырабатываемых к ним антител. Для серодиагностики могут использоваться как нативные антигены (бактериальные клетки, вирусные частицы, нативные белки), так и синтетические молекулы.

Применение рекомбинантных полипептидов, создаваемых современными генно-инженерными методами, является наиболее перспективным направлением в разработке иммунобиологических диагностикумов, поскольку практически исключается работа с опасными агентами. Использование в иммунобиологических тест-системах в качестве антигенов рекомбинантных полипептидов предполагает чрезвычайно высокие требования к степени их очистки для достижения высоких качественных показателей: специфичности и чувствительности диагностических тестов.

Проблема диагностики и лечения острых геморрагических лихорадок очень актуальна в настоящее время. Являясь природно-очаговыми вирусными заболеваниями, они характеризуются общими клиническими проявлениями независимо от природы возбудителя: развитием геморрагического синдрома на фоне остролихорадочного состояния. Лихорадка Марбург, входящая в их число, является особо опасной вирусной инфекцией, этиологическим агентом которой является РНК-геномный вирус из семейства Filoviridae [1].

Целью настоящего исследования явилось создание векторной конструкции, обеспечивающей экспрессию в прокариотической системе рекомбинантного полипептида, включающего антигенные детерминанты нуклеокапсидного белка вируса Марбург; получение и возможность использования высокоочищенного рекомбинантного полипептида в качестве антигена для выявления специфических антител к вирусу Марбург методом иммунного блоттинга.

Материал и методы

В работе использовали вирус Марбург, штамм Voege, полученный из специализированной коллекции вирусов и бактерий, патогенных для человека, РНПЦ эпидемиологии и микробиологии Минздрава Республики Беларусь и референс-сыворотку, содержащую антитела к вирусу Марбург, полученную от доктора MacCormik (США). В качестве экспрессирующего вектора применяли бактериальный штамм Е. coli BL21 (DE3).

Топологический анализ аминокислотной последовательности нуклеокапсидного белка вируса Марбург с целью поиска антигензначимых участков проводили с использованием авторской компьютерной программы «wxGeneBee». За основу в данной программе взяты шкалы гидрофобности и гидрофильности, предложенные Hopp and Woods (1981) и Kyte and Doolitle (1982), критериями оценки которых являются такие параметры, как растворимость, заряд, удаленность от NC-остова, наличие спиралей, наличие сульфгидрильных остатков.

В качестве исходной матрицы для постановки обратной транскрипции брали вирусную РНК, которую получали из вируссодержащей культуральной жидкости. Выделение РНК осуществляли с помощью коммерческого набора реагентов «NucleoSpin RNA» (MACHERY-Nagel) согласно прилагаемой инструкции.
 
ЛИТЕРАТУРА
1.    Martini G., Siegert R. Marburg virus disease.— Berlin, 1971.
2.    Семижон П. А., Фомина E. Г., Школина T.B. и др.// Здравоохранение.— 2006.— № 11.— С. З5—З7.
3.    Hochuli Е., Bannwarth W., Dobeli Н., et al. // Nature Biotechnology.— 1988.— Vol. 6.— P. 1З21—1З25.
4.    Laemmli U. //Nature.— 1970.— № 227.— P. 680—685.
5.    Clos J., Brandau S. // J. Protein Express. Purificat.— 1994.— Vol. 5.— P. 1ЗЗ—1З7.
6.    Armstrong D. J., Roman A. // Biochem. Biophys. Res. Commun.— 199З.— Vol. 192.— P. 1З80—1З87.
7.    Garcia-Ortega L., De los Rios V., Martinez-Ruiz A., et al. // Electrophoresis.— 2005.— Vol. 26 (Iss. 16).— P. З407—З41З.
8.    Белова H. Ф., Фомина E. Г., Школина T.B. и др. // Современные проблемы инфекционной патологии человека: Сб. науч. трудов.— Минск, 2005.— С. З40—З46.

Поступила 08.07.14.

Адрес для корреспонденции:
Счесленок Елена Павловна.
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии.
220114, г. Минск, ул. Филимонова, 23; сл. тел. (8-017) 268-04-19.

  • Я только что вернулся с большого международного форума врачей и ученых, проходившего в Санкт-Петербурге. На нем обсуждались вопросы совершенствования диагностики и лечения хронического миелолейкоза. Мы теперь уже добились того, что продолжительность жизни таких больных увеличилась в четыре раза, в России уже живут, радуются жизни и трудятся люди, излеченные от этого тяжелого заболевания... На форуме наряду с отечественными клиницистами выступали гематологи из Хьюстона (США), Турина (Италия), Мангейма (Германия).
  • Я вспоминаю свои беседы с больными — преподавателями медицинского института, профессорами. Что говорить, трудно с ними работать! Трудно с ними говорить и действовать, как со всеми остальными пациентами...Что еще характерно для заболевшего врача в психологическом плане? Частенько такой пациент напрочь забывает не только действие препаратов, но и время их приема, хотя сам в своей жизни неоднократно назначал их.
  • При осмотре мы прежде всего также уделяем особое внимание кожному покрову. Нормальная кожа и изменения ее при различных заболеваниях довольно подробно представлены в учебниках и монографиях. Здесь мне хочется лишь привести некоторые сведения, которые будут интересны врачам различных специальностей и позволят понять, почему кожа претерпевает изменения. Известно, что кожа — это полноценный орган, который дополняет и дублирует функции различных внутренних органов. Она активно участвует в процессе дыхания, выделения, обмене веществ.
  • Я никогда не заканчиваю расспроса-беседы с больным без того, чтобы выяснить хотя бы ориентировочно состояние взаимоотношений в семье. Полипрагмазия — бич современной медицины, клиники внутренних болезней. На обходах часто приходится видеть, как больным назначают 13—16 препаратов, нередко с взаимоисключающими фармакологическими свойствами.
  • Изучив сотни диагностических ошибок, сотрудники нашего коллектива убедились, что в ходе диагностического процесса практические врачи нарушают даже самые элементарные правила логики. Например, они неправильно применяют методы аналогии, индукции, дедукции.
  • А в настоящее время мне самому приходилось и в поликлиниках, и в стационарах слышать такие «уважительные и милые» обращения медицинских работников (и даже студентов, которые берут со старших пример!!!), как «голубушка», «бабуля», «золотце», «милочка», «голубчик», «бабуся», «дедуся», «дедуля», «женщина», «человек», «старик», «папаша», «мамаша», «отец», «мать», «барышня», «мужик», «тетя», «дядя» и т. д. Многие из таких слов для больных обидны, полны презрения, как правило, задевают самолюбие пациентов и их родственников.
  • Он редко выслушивал до конца доклад о больном, часто сразу же задавал вопросы, уточняющие характер течения болезни, особенности жизни. Удивительно, что вслух он мог сказать: «Что-то тут мне не ясно. Чего-то не хватает в истории болезни». И начинал сам собирать и выяснять эти «недостающие звенья».
© Редакция журнала «Здравоохранение» - 1924 - 2014гг.
Разработка сайта - doktora.by - сайт для врачей Беларуси