Сравнительная противовирусная активность нативных тритерпеноидов

Цель исследования. Изучение противовирусных свойств природных тритерпеновых соединений в экспериментах на культуре клеток и лабораторных животных.

Материал и методы. Лупеол, бетулин, бетулоновая и бетулиновая кислоты синтезированы в Институте органической химии Уфимского научного центра РАН. Их противовирусные свойства определяли в экспериментах на культурах клеток с вирусами простого герпеса 1-го типа, гриппа A/FPV/Rostock/34 (H7N1) и ECHO 6. При выполнении экспериментов на животных использовали беспородных белых мышей, экспериментальные мази бетулина и бетулиновой кислоты, а также ацикловира и бутаминофена как препаратов сравнения.

Результаты. Установлено, что исследованные вещества обладают наиболее высокой ингибирующей активностью в отношении вируса герпеса, в частности бетулин, бетулиновая и бетулоновая кислоты. В отношении вирусов гриппа А (H7N1) и ECHO 6 эти соединения неактивны или проявляют малозаметную активность. В экспериментах на лабораторных животных (кожный герпес белых мышей) наиболее высока эффективность мази бетулина.

Заключение. Полученные данные свидетельствуют о перспективности природных тритерпеновых соединений для разработки на их основе противовирусных лекарственных средств.

Из индивидуальных веществ, получаемых из растительного сырья, значительное внимание уделяется тритерпеноидам. Характерными представителями природных лупановых тритерпеноидов являются лупеол, бетулин, бетулиновая и бетулоновая кислоты.

Интерес к противовирусным свойствам соединений тритерпенового ряда вызван тем, что производные бетулиновой кислоты идентифицированы как новый класс потенциально селективных ингибиторов ВИЧ-1 [1]. Считается, что производные бетулиновой кислоты блокируют начальные (слияние) и/или заключительные стадии взаимодействия вируса с клеткой. Поскольку стадия слияния является общей для всех оболочечных вирусов, рабочей гипотезой при выполнении исследования стало предположение, что противовирусные свойства производных бетулиновой кислоты, вероятно, не ограничиваются только ВИЧ [2].

Целью настоящего исследования явилось исследование противовирусных свойств природных тритерпеновых соединений в экспериментах на культуре клеток и лабораторных животных.

Материал и методы

В работе использовали вирусы простого герпеса 1-го типа (ВГП-1), гриппа A/FPV/Rostock/34 (H7N1) и ECHO 6, полученные из Национальной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН. Бетулин, бетулоновая и бетулиновая кислоты, а также другие тритерпеноиды синтезированы в Институте органической химии Уфимского научного центра РАН.

Противовирусные свойства определяли в экспериментах на культурах клеток методом редукции бляшек на культуре первичных фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) с FPV и методом оценки цитопатического эффекта (ЦПЭ) на культуре клеток рабдомиосаркомы человека (RD) с ВПГ-1 и вирусом ECHO 6, как описано нами ранее [3]. Изучаемые соединения предварительно растворяли в 10% растворе этанола и затем готовили ряд последовательных разведений на среде поддержки, как правило, двукратных, до получения требуемых концентраций. Критерием противовирусного действия считали снижение титра вируса в присутствии соединений в сравнении с контролем. Вычисляли также концентрации 50% и 95% подавления размножения вируса (среднеи 95% эффективная концентрации — EC50 и ЕС95) и отношение максимальной переносимой концентрации (МПК) к EC50 и ЕС95. МПК соединений для неинфицированных культур клеток определяли после 72 ч инкубации.

Вирулицидные свойства исследовали в отношении ВПГ-1. Вирусосодержащую суспензию объединяли с равным объемом разведений исследуемого вещества на среде поддержки. Смесь выдерживали при комнатной температуре в течение 60 мин. Инфекционность остаточного вируса определяли по наличию ЦПЭ методом конечных разведений. Снижение титра вируса под влиянием исследуемого вещества за время экспозиции вычисляли как разность между значениями снижения титра вируса в точках «0» (без экспозиции) и «60» (с экспозицией).

При выполнении экспериментов на животных использовали беспородных самцов белых мышей массой 20—25 г (Институт биоорганической химии НАН Беларуси), ВПГ 1-го типа (ВПГ, штамм 1 С), экспериментальные мази ацикловира (2,5%) и бутаминофена (1%), подготовленные в РУП «Белмедпрепараты». Вирус поддерживали в рабочем титре (6 lg ТЦИД50/мл) пассированием на культуре клеток RD. Экспериментальный герпес мышей воспроизводили согласно методу, описанному М. R. Boyd и соавт. [4], с некоторыми изменениями, имеющими отношение в основном к способу наркотизации и используемому штамму вируса. Животных вводили в наркоз с помощью эфира до начала стадии засыпания. Внутреннюю поверхность правой ушной раковины каждой мыши скарифицировали инъекционной иглой, затем наносили 20 мкл вирусосодержащей жидкости (среда DMEM с 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота). Лечение животных (по 5—7 в каждой группе) начинали на следующий день после инфицирования и продолжали в течение 5 сут. Мази наносили 3 раза в сутки (9:00, 15:00 и 21:00). Об эффективности препаратов судили по степени развития признаков поражения, основными из которых являлись обратимые эритема и пузырьки (корки, струпы, язвы на месте их образования), а также необратимые несращения и перфорации тканей уха в местах скарификации. Наличие эритемы в зависимости от степени выраженности и площади охвата оценивали в 0,5 балла или 1 балл; наличие везикул, корок, струпов, язв — от 1 до 2 баллов (I — изолированные поражения, 2 — сливные). Оценки эритемы и наличия везикул суммировали. Для каждой группы животных вычисляли средний балл. Необратимые несращения мест скарификации или перфорации тканей уха оценивали отдельно как дополнительный признак, поскольку в общей сумме оценок он мешал определению сроков выздоровления.

Учитывая неодинаковую начальную реакцию на скарификацию после инфицирования, усредненные экспериментальные данные подвергали дополнительной обработке. Вычисляли общее среднее значение оценок для всех групп животных в 1-е сутки после инфицирования (хср). Разность средних оценок в отдельных группах в 1-е сутки наблюдения с общим средним значением (хср—х(.) суммировали со средними оценками в группах, если поражения в 1-е сутки были ниже, или вычитали, если поражения были выше среднего значения. Далее из полученных результатов вычитали среднюю оценку реакции на скарификацию в группе неинфицированных животных по суткам [S].
Статистическую обработку результатов для оценки достоверности различий между средними значениями в группах животных проводили с использованием общепринятых методов вариационной статистики (t-критерий).

ЛИТЕРАТУРА
1.    Soler F., Poujade C., Evers М., et al. // Med. Chem.— 1996.— Vol. 39, № S.— P. 1069—1083.
2.    Boreko E. I., Pavlova N. I., Savinova О. V., et al. //N. Biomed. Sci. (Весц HAH Беларуа. Сер. мед.-биол. навук).— 2002.— № 3.— P. 86—90.
3.    Бореко E. И., Павлова H. И., Зайцева Г.В. и др. // Вопр. вирусологии.— 2001.— № S.— С. 40—42.
4.    Boyd М. R., Bacon Т. N., Sutton D. // Antimicrob. Ag. Chemother.— 1988.— Vol. 32, № 1.— P. 358—363.
5.    Бореко E. И., Савинова О. В., Павлова H. И. и др. // Соврем. пробл. инф. патологии человека (эпидемиол., клиника, вирусол., микробиол. и иммунол.): Материалы НИИ эпидемиол. и микробиол. по итогам выполнен. ГНТП «Инфекции и мед. биотехнол.» 2001—2005 гг.— Минск, 2005.— С. 417—424.
6.    Вотяков В. И., Бореко E. И., Владыко Г.В. и др. Первичное изучение антивирусных свойств синтетических и природных соединений: Методич. рекомендации.— Минск, 1986.
7.    Spruance S. L., Freeman D. J., Sheth N. V. //Antimicrob. Ag. Chemother.— 1985.— Vol. 28, № 1.— P. 103—106.
8.    Spruance S. L., McKeough M. B., Cardinal J. R. // Antimicrob. Ag. Chemother.— 1984.— Vol. 25, № 1.— P. 10—15.

Поступила 08.07.14.

Адрес для корреспонденции:
Бореко Евгений Иванович.
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии.
220114, г. Минск, ул. Филимонова, 23; сл. тел. (8-017) 267-32-67.

Ключевые слова: , , , , ,
Автор(ы): Бореко Е. И., Павлова Н. И., Савинова О. В.
Медучреждение: РНПЦ эпидемиологии и микробиологии Минздрава Республики Беларусь