Получение и характеристика рекомбинантного полипептида нуклеокапсидного белка вируса Марбург

Цель исследования. Клонирование, экспрессия в прокариотическои системе и характеристика рекомбинантного полипептида, представляющего антигензначимыи участок нуклеокапсидного белка вируса Марбург.

Материал и методы. В качестве исходного материала в работе использован вирус Марбург, штамм Voege, полученный из специализированной коллекции вирусов и бактерии, патогенных для человека, РНПЦ эпидемиологии и микробиологии. Для экспрессии рекомбинантного белка использовали бактериальный штамм Е. coli BL21 (DE3). Использованы стандартные генно-инженерные, молекулярно-биологические и серологические методы исследования.

Результаты. С использованием генно-инженерных методов исследования получена гибридная векторная конструкция pJC40/NP MAR, обеспечивающая экспрессию рекомбинантного полипептида вируса Марбург в прокариотическои системе Е. coli, штамм BL 21 (DE3). Показана возможность использования высокоочищенного рекомбинантного полипептида для выявления специфических антител к вирусу Марбург методом иммунного блоттинга.

Заключение. Сконструирована плазмида pJC40/NP MAR, в прокариотическои системе Е. coli экспрессирован рекомбинантныи полипептид, представляющии антигензначимыи участок нуклеокапсидного белка вируса Марбург. Получен очищенныи рекомбинантныи полипептид вируса Марбург, не содержащии примесеи бактериальных белков, обладающии антигенными своиствами.

Развитие международных интеграционных и экономических процессов, межэтнические и культурные контакты, миграционные потоки населения в силу экологических или экономических факторов приводят к возникновению новых или расширению ареалов известных опасных и особо опасных природно-очаговых инфекционных заболеваний.

Лабораторная диагностика инфекционных заболеваний представляет собой важное звено системы здравоохранения. Профилактика и лечение любого заболевания значительно облегчается ранней и точной идентификацией вызвавшего его патогенного микроорганизма. Одним из основных путей создания эффективных диагностических препаратов для выявления возбудителей инфекционных заболеваний является серодиагностика, основанная на аффинном взаимодействии антигенов и вырабатываемых к ним антител. Для серодиагностики могут использоваться как нативные антигены (бактериальные клетки, вирусные частицы, нативные белки), так и синтетические молекулы.

Применение рекомбинантных полипептидов, создаваемых современными генно-инженерными методами, является наиболее перспективным направлением в разработке иммунобиологических диагностикумов, поскольку практически исключается работа с опасными агентами. Использование в иммунобиологических тест-системах в качестве антигенов рекомбинантных полипептидов предполагает чрезвычайно высокие требования к степени их очистки для достижения высоких качественных показателей: специфичности и чувствительности диагностических тестов.

Проблема диагностики и лечения острых геморрагических лихорадок очень актуальна в настоящее время. Являясь природно-очаговыми вирусными заболеваниями, они характеризуются общими клиническими проявлениями независимо от природы возбудителя: развитием геморрагического синдрома на фоне остролихорадочного состояния. Лихорадка Марбург, входящая в их число, является особо опасной вирусной инфекцией, этиологическим агентом которой является РНК-геномный вирус из семейства Filoviridae [1].

Целью настоящего исследования явилось создание векторной конструкции, обеспечивающей экспрессию в прокариотической системе рекомбинантного полипептида, включающего антигенные детерминанты нуклеокапсидного белка вируса Марбург; получение и возможность использования высокоочищенного рекомбинантного полипептида в качестве антигена для выявления специфических антител к вирусу Марбург методом иммунного блоттинга.

Материал и методы

В работе использовали вирус Марбург, штамм Voege, полученный из специализированной коллекции вирусов и бактерий, патогенных для человека, РНПЦ эпидемиологии и микробиологии Минздрава Республики Беларусь и референс-сыворотку, содержащую антитела к вирусу Марбург, полученную от доктора MacCormik (США). В качестве экспрессирующего вектора применяли бактериальный штамм Е. coli BL21 (DE3).

Топологический анализ аминокислотной последовательности нуклеокапсидного белка вируса Марбург с целью поиска антигензначимых участков проводили с использованием авторской компьютерной программы «wxGeneBee». За основу в данной программе взяты шкалы гидрофобности и гидрофильности, предложенные Hopp and Woods (1981) и Kyte and Doolitle (1982), критериями оценки которых являются такие параметры, как растворимость, заряд, удаленность от NC-остова, наличие спиралей, наличие сульфгидрильных остатков.

В качестве исходной матрицы для постановки обратной транскрипции брали вирусную РНК, которую получали из вируссодержащей культуральной жидкости. Выделение РНК осуществляли с помощью коммерческого набора реагентов «NucleoSpin RNA» (MACHERY-Nagel) согласно прилагаемой инструкции.

ЛИТЕРАТУРА
1.    Martini G., Siegert R. Marburg virus disease.— Berlin, 1971.
2.    Семижон П. А., Фомина E. Г., Школина T.B. и др.// Здравоохранение.— 2006.— № 11.— С. З5—З7.
3.    Hochuli Е., Bannwarth W., Dobeli Н., et al. // Nature Biotechnology.— 1988.— Vol. 6.— P. 1З21—1З25.
4.    Laemmli U. //Nature.— 1970.— № 227.— P. 680—685.
5.    Clos J., Brandau S. // J. Protein Express. Purificat.— 1994.— Vol. 5.— P. 1ЗЗ—1З7.
6.    Armstrong D. J., Roman A. // Biochem. Biophys. Res. Commun.— 199З.— Vol. 192.— P. 1З80—1З87.
7.    Garcia-Ortega L., De los Rios V., Martinez-Ruiz A., et al. // Electrophoresis.— 2005.— Vol. 26 (Iss. 16).— P. З407—З41З.
8.    Белова H. Ф., Фомина E. Г., Школина T.B. и др. // Современные проблемы инфекционной патологии человека: Сб. науч. трудов.— Минск, 2005.— С. З40—З46.

Поступила 08.07.14.

Адрес для корреспонденции:
Счесленок Елена Павловна.
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии.
220114, г. Минск, ул. Филимонова, 23; сл. тел. (8-017) 268-04-19.

Ключевые слова: , , , , , , ,
Автор(ы): Счесленок Е. П., Семижон П. А., Школина Т. В., Фомина Е. Г., Дубков Н. А., Владыко А. С.
Медучреждение: РНПЦ эпидемиологии и микробиологии Минздрава Республики Беларусь