Индикация Chlamydia trachomatis с помощью иммуномагнитных флюоресцентных наночастиц при персистентной форме инфекции

Цель исследования. Разработать и апробировать методику индикации С. trachomatis с использованием активированных сенсорных поверхностей и функционально активных композиционных конъюгатов иммуномагнитных частиц, содержащих флюоресцентную метку.

Материал и методы. Соскобный материал из урогенитального тракта 45 пациентов исследован культуральным методом, ПЦР, МФА и с помощью сконструированного «микрочипа» и флюоресцентных иммуномагнитных наночастиц. В качестве положительного контроля в экспериментах использовали лабораторный штамм С. trachomatis СТ-869. Детекцию ДНК возбудителя осуществляли с помощью ПЦР тест-системы «АмплиСенс Chlamydia trachomatis» — Eph. Реакцию иммунофлюоресценции проводили с использованием тест-системы «ХламиСкан». В качестве отрицательного контроля использовали интактную 2-суточную культуру клеток McCoy.

Основой (матрицей) для создания сенсорной поверхности «микрочипа» являлись стандартные предметные 8-луночные стеклянные планшеты с химически модифицированной поверхностью и иммобилизованными противохламидийными антителами. Для индикации возбудителя использовали функционально активные композиционные флюоресцентные иммуномагнитные микросферы (ММС). Учет результатов осуществляли на флюоресцентном микроскопе.

Результаты. Продемонстрирована эффективность выбранного нанотехнологического подхода к детекции С. trachomatis в пробах биологического материала, в том числе первичном соскобном материале пациентов с урогенитальной патологией.
Получены достаточно высокие показатели информативности индикации С. trachomatis с использованием активированных сенсорных поверхностей и функционально активных композиционных конъюгатов иммуномагнитных частиц, содержащих флюоресцентную метку: чувствительность — 96,3%, специфичность — 100%, точность — 97,8%.

Показано, что конъюгаты ММС способны селективно связываться и концентрировать возбудителя на своей поверхности в диапазоне 5—200 частиц С. trachomatis на реакцию (Ме 60 частиц), что свидетельствует о возможности индикации возбудителя даже при низких концентрациях его в образце.
Заключение. Методом иммуномагнитной сепарации c использованием ММС, покрытых биосовместимой оболочкой и конъюгированных с аффинными противохламидийными антителами, продемонстрирована возможность детекции небольших количеств С. trachomatis в биологическом материале. Создан аналитический «микрочип» и получены конъюгаты ММС с флюоресцентной меткой, которые позволяют проводить индикацию и идентификацию патогена как при острой, так и персистентной форме инфекции.

Заболеваемость урогенитальным хламидиозом (УГХ) во всем мире по-прежнему остается высокой.

В 2012 г. в Швеции зарегистрировано 394,4 случая УГХ на 100тыс. населения, Дании — 476,7, Финляндии — 244,8, США — 456,7, Республике Беларусь — 93,8 случая на 100 тыс. населения (http://www.cdc.gov, http://www.epinorth.org). Особое внимание к данной инфекции обусловлено тем, что зачастую она протекает в хронической форме и приводит к серьезнейшим осложнениям не только урогенитального тракта, но и костно-суставной, дыхательной, пищеварительной, нервной и сердечно-сосудистой систем организма человека [1—3]. Считают, что известные 19 генотипов возбудителя отличаются по вирулентности, патогенности, репродуктивной активности. Показано, что серовары G, I и D ассоциированы с развитием рака шейки матки, а серовар К— с бесплодием. Проводившимися ранее эпидемиологическими исследованиями установлена циркуляция на территории Республики Беларусь генотипов D, К и С [4—6]. Недавно были типированы штаммы С. trachomatis, относящиеся к генотипам B, G и J, в том числе и бесплазмидные варианты. Зачастую инфекция протекает в хронической форме и приводит к серьезнейшим осложнениям (бесплодию, самопроизвольным выкидышам, эктопическим и замершим беременностям, внутриутробному инфицированию плода, патологии новорожденного). Почему происходит хронизация хламидийной инфекции до конца не изучено.

Жизненный цикл возбудителя уникален и связан с образованием различных по морфологии и функциональной активности форм паразита: внеклеточных элементарных, внутриклеточных промежуточных и ретикулярных телец. Способность хламидий к трансформации в L-подобную форму или переход в другие морфологические формы (аберрантные, дефектные) осложняет диагностику хламидийной инфекции. Несмотря на существование достаточно широкого арсенала лабораторных методов (МФА, ИФА, ПЦР, культуральный), наиболее трудными с точки зрения лабораторной верификации остаются бессимптомные формы персистентной хламидийной инфекции, распространенность которых составляет 17—70% [5, 7]. Поэтому актуальным является совершенствование имеющихся и разработка новых методов лабораторной диагностики С. trachomatis с использованием нанотехнологических подходов.

В последнее десятилетие активное развитие нанобиотехнологии и ее достижения находят все большее применение в биологии и медицине [7—12]. Открытие так называемых квантовых точек — полупроводниковых нанокристаллов размерами 2—10 нм, обладающих уникальными флюоресцентными свойствами, послужило основой для разработки новых флюоресцентных меток. Успехи в развитии методов синтеза флюоресцентных нанокристаллов с заданными свойствами и методов функционализации их поверхности открыли пути к созданию нового класса флюорофоров для многочисленных биологических и медицинских применений. Флюоресцентные нанокристаллы детектируются как индивидуальные объекты с помощью обычных флюоресцентных микроскопов, что позволяет визуализовать процессы на уровне единичных молекул.

Достоинством нанокристаллов по сравнению с органическими флюорофорами является их высокая яркость, обусловленная большим коэффициентом поглощения, уникально высокая фотостабильность и узкий, симметричный пик эмиссии. Длина волны флюоресценции нанокристаллов зависит от их размеров, при этом для возбуждения нанокристаллов всех цветов достаточно одного источника излучения. Такие уникальные свойства делают нанокристаллы идеальными флюорофорами для сверхчувствительной детекции биологических объектов и медицинской диагностики.

В связи с вышеизложенным изыскания, направленные на применение биомаркеров нового поколения для медицинской диагностики, в том числе для индикации С. trachomatis при персистентной форме инфекции, являются перспективным направлением нанобиотехнологии.
Целью работы является разработка и апробация методики индикации С. trachomatis с использованием активированных сенсорных поверхностей и функционально активных композиционных конъюгатов иммуномагнитных частиц, содержащих флюоресцентную метку.

Материал и методы

Для проведения исследования использовали соскобный материал из урогенитального тракта 26 пациентов с лабораторно верифицированной хламидийной инфекцией, а также образцы клинического материала 19 пациентов, в котором наличие возбудителя— С. trachomatis — не было подтверждено ни одним из методов (культуральный, ПЦР, МФА). Материал предварительно вносили в транспортную среду, обеспечивающую выживание С. trachomatis при транспортировке и хранении (-20°С, 1—2 сут). С целью удаления избытка клеточного «дебриса» при изоляции возбудителя и повышения концентрации хламидийных частиц во внеклеточной среде проводили предварительную пробоподготовку исследуемых биопроб по методу, предложенному E. Wahlstrom и соавт. [13].

В качестве положительного контроля использовали штамм С. trachomatis СТ-869 (титр 5 lg ТЦД50/мл) — депонент B-04/2012 от 10.10.2012— из специализированной коллекции вирусов и бактерий РНПЦ эпидемиологии и микробиологии. Детекцию ДНК возбудителя осуществляли с помощью ПЦР (тест-система «АмплиСенс С. trachomatis» — Eph ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора», Россия). Реакцию иммунофлюоресценции проводили с помощью тестсистемы «ХламиСкан» («ЛабДиагностика», Россия). В качестве отрицательного контроля использовали интактную 2-суточную культуру клеток McCoy.

Основой (матрицей) для создания сенсорной поверхности «микрочипа» являлись стандартные предметные 8-луночные стеклянные планшеты. Модификация поверхности планшетов включала проведение 2 основных этапов: химическая очистка их поверхности и формирование силоксанового слоя путем обработки 3-аминоприпропилтриэтоксисиланом (АПТЭС). С целью получения сенсорных покрытий на стеклянную поверхность последовательно из водных растворов осаждали карбоксиметилдекстран (КМД) и авидин (1 мг/мл) (A9275, «Sigma», США), после чего осуществляли целенаправленную иммобилизацию в заданные лунки «микрочипа» поликлональных противохламидийных антител (РА1-27223, «ThermoFisher Scientific», США), направленных к различным поверхностным антигенам С. trachomatis. Исследования всех проб с помощью сконструированного «микрочипа» проводили 3-кратно, включая использование лунок, не активированных противохламидийными антителами.

Для индикации возбудителя использовали композиционные флюоресцентные иммуномагнитные микросферы (ММС), которые получали методами коллоидной химии. С целью исключения неспецифического связывания оболочку ММС модифицировали КМД, затем проводили активацию поверхности магнитного носителя через авидинобиотиновую связь биотинилированными противохламидийными антителами. Учет результатов осуществляли на флюоресцентном микроскопе «Nikon Е50i» (Япония) при возбуждающем свете с длиной волны 490 нм и фильтром 520—540 нм. Статистический анализ данных проводили с использованием программного обеспечения STATISTICA 6.0 («StatSoft Inc.»). Количественные признаки при нормальном распределении представлены в виде среднего арифметического и среднего квадратического отклонения или в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха [25%; 75%] при распределении, отличном от нормального. Для анализа взаимосвязи между показателями использовали U-критерий Манна— Уитни, непараметрический двусторонний коэффициент корреляции Спирмена (rs). Для сравнения 2 независимых выборок использовали t-критерий Стьюдента и точный двусторонний критерий Фишера. За уровень статистической значимости принимался P<0,05.

ЛИТЕРАТУРА
I.    Исаков В. И., Куляшова Л. Б., Березина Л. А., Сварваль А. В. // Terra Medica.— 2012.— № 2.— С. 8—13.
P. Зигангирова Н. А., Петяев И. В., Пашко Ю. П. и др. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия.— 2007.— Том 9, № 4.— С. 351—360.
3.    Козлова В. И., Пухнер А. Ф. Вирусные, хламидийные и микоплазменные заболевания гениталий: Руководство для врачей.— М., 2003.
4.    Рубаник Л. В. Лабораторная диагностика хламидийно-герпетической и трихомонадной урогенитальной инфекции у людей с материалами экспериментальных исследований по разработке лечебной моновакцины на основе авторского штамма Chlamydia trachomatis: Автореф. дис. … канд. биол. наук.— Минск, 2007.
5.    Рубаник Л. В., Асташонок А. Н., Полещук Н. Н. Известия НАН Беларуси. Серия медицинских наук.— 2011.— № 4.— С. 110—114.
6.    Хворик Д. В. Урогенитальный хламидиоз.— Минск, 2009.
7.    Рищук С. В. // Terra Medica.— 2013.— № 2.— С. 9—21.
8.    AbdelRahman Y. M., Belland R. J. // FEMS Microbiol. Rev.— 2005.— Vol. 29.— P. 949—959.
9.    Штыков С. Н., Русанова Т. Ю. // Рос. хим. журн.— 2008.— № 2.— С. 92—99.
10.    Олейников В. А., Суханова А. В., Набиев И. Р. // Рос. нанотехнологии.— 2007.— Том 2, № 1—2.— С. 160—172.
II.    Улащик В. С. //Здравоохранение.— 2009.— № 2.— С. 4—10.
12.    Ткачук В. А. // Рос. нанотехнологии.— 2009.— Том 4, № 7—8.— С. 11—13.
13.    Wahlstrom E., Vaananen P., Saikku P., Nurminen M. // FEMS Microbiol. Lett.— 1984.— Vol. 24.— P. 179—183.
14.    Полещук Н. Н, Асташонок А. Н., Рубаник Л. В. и др. // Наноиндустрия.— 2012.— № S.— С. 48—54.
15.    Костюк С. А., Кулага О. К., Хворик Д. Ф. Мед. новости.— 2006.— № S.— C. 14—19.
16.    Федорова В. А., Коннова С. С., Полянина Т.И. и др. // Изв. Саратов. гос. университета. Серия Химия. Биология. Экология.— 2011.— Том 11, вып. 2.— С. 73—77.
17.    Ripa T., Nilsson P. //Sex. Transm. Dis.— 2007.— Vol. 34.— P. 255—256.
18.    Herrmann B., Torner A., Low N., et al. //Emerg. Infect. Dis.— 2008.— Vol. 14.— P. 1462—1465.
19.    Дембски С., Пробст Й., Геллерманн К. и др. // Наноиндустрия.— 2012.— № 2.— С. 56—59.
20.    Чечеткин В. Р., Прокопенко Д. В., Макаров А. А., Заседателев А. С.// Рос. нанотехнологии.— 2006.— № 1.— C. 13—27.
21.    Разумов А. С. Медицина в Кузбассе.— 2009.— № 2.— С. 3—11.
22.    Lazcka О., Campo F. J., Munoz F. X. // Biosens. Bioelectron.— 2007.— Vol. 22.— С. 1205—1217.
23.    Zubtsova Zh. I., Zubtsov D. A., Savvatteeva E. N., et al. // Biotechnology.— 2009.— Vol. 144.— P. 151—159.

Поступила 08.08.14.

Адрес для корреспонденции:
Рубаник Людмила Владимировна.
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии.
220114, г. Минск, ул. Филимонова, 23; сл. тел. 267-95-92.

Ключевые слова: , , ,
Автор(ы): Рубаник Л. В., Асташонок А. Н., Жавнерко Г. К., Полещук Н. Н.
Медучреждение: РНПЦ эпидемиологии и микробиологии Минздрава Республики Беларусь