Генетическое разнообразие вируса гепатита С у детей со злокачественными новообразованиями

В рамках проведенных молекулярно-генетических исследований установлена частота выявления различных генотипов вируса гепатита С (ВГС) у детей со злокачественными новообразованиями (ЗН) на территории Республики Беларусь. Показано, что наиболее распространенным среди детей данной группы являются подгенотипы 1b (88,1%), 3а (7,1%) и 1а (2,4%). Аналогичные данные получены при генотипировании вируса по участку N55 генома вируса. Так, в 91,2% исследованных проб выявлен подгенотип 1b, в 5,9% — 3а и 2,9% — 1а. У 1 ребенка обнаружена рекомбинантная форма вируса 1d/1b. Установлено, что 1b-подгенотип ВГС, выделенный у пациентов с ЗН, образует самостоятельные филогенетические кластеры, что указывает на множественное инфицирование данным подгенотипом вируса.

Широкое распространение, множественность путей передачи и недостаточно разработанная терапия делают проблему вирусных гепатитов одной из наиболее актуальных в здравоохранении. Это касается как острой, так и хронической форм гепатита, вызываемых вирусом гепатита С (ВГС).

По оценочным данным, в мире около 3% от всего населения инфицировано ВГС [1]. Играя незначительную роль в этиологической структуре острых вирусных гепатитов, он является ведущим в развитии хронических форм поражений печени у 70—85% пациентов. Через 15—20 лет после инфицирования почти у половины зараженных лиц ВГС вызывает развитие цирроза печени (ЦП) или гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). Ежегодно в Беларуси около 3 тыс. человек заболевают ВГС, 10% из них составляют дети в возрасте до 18 лет.

Риск неблагоприятного исхода заболевания с развитием ЦП или ГЦК у хронически инфицированных пациентов значительно повышается при инфицировании ВГС в детстве.

Особую актуальность эта проблема имеет для пациентов со злокачественными новообразованиями (ЗН). В России общая инфицированность детей вирусами гепатитов В и С, перенесших ЗН, достигает 75%. Из них 25—30% случаев вызваны вирусом гепатита В (ВГВ), 35—45% — ВГС. Значительное количество пациентов приобретало ВГСинфекцию в процессе лечения основного заболевания. После введения рутинного скрининга донорской крови на наличие антител к ВГС количество новых случаев существенно уменьшилось, однако распространенность ВГС-инфекции по-прежнему составляет от 6 до 15% как у взрослых, так и у детей [2]. Это объясняется тем, что путь инфицирования пациентов ВГС через донорскую кровь или ее продукты для таких пациентов является не единственным. В настоящее время известны также случаи внутрибольничного инфицирования ВГС пациентов, находящихся на гемодиализе, через медицинское оборудование, в гематологических отделениях, при хирургических вмешательствах [3—5]. Высокий уровень инфицирования вирусами гепатитов у пациентов с ЗН обусловлен проведением частых инвазивных вмешательств и массивной трансфузионной нагрузкой, связанной с полихимиотерапией (ПХТ), иммуносупрессией и токсическим медикаментозным поражением печени. Показано, что риск инфицирования ВГС при ЗН прямо пропорционален количеству переливаний крови и ее препаратов [6].

Хронические вирусные гепатиты (ХВГ) у детей с ЗН в большинстве случаев протекают латентно, что не позволяет своевременно их диагностировать. В связи с этим необходимо применять методы, позволяющие выявлять возбудителя в ранние сроки инфицирования и, соответственно, предотвращать развитие хронической формы инфекции. У пациентов с ЗН, получающих ПХТ, диагностика ВГС имеет некоторые особенности, поскольку отмечается снижение синтеза противовирусных антител вследствие иммуносупрессивного действия данного вида терапии. В связи с этим после инфицирования сероконверсия, то есть появление антител к ВГС, на фоне такой терапии может произойти намного позже или не произойти вовсе. В настоящее время наиболее надежным и специфичным методом лабораторной диагностики для данной группы пациентов является определение РНК ВГС методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Молекулярно-генетические исследования, направленные на выявление генетических маркеров ВГС, позволяют не только определить присутствие вируса в пробе, провести идентификацию его генотипа, что важно при выборе тактики терапии, поскольку установлена связь между генотипом вируса и тяжестью течения заболевания, но и определить родственные связи между вирусами.

В настоящее время выделяют 7 генотипов и 67 подгенотипов ВГС, которые имеют различное географическое распространение [7]. Помимо генотипов/ подгенотипов ВГС описана циркуляция рекомбинантных форм вируса. Процесс рекомбинации для ВГС является достаточно редким явлением и происходит как между разными генотипами, так и между подгенотипами одного генотипа. В настоящее время описаны 2k/1b, 1b/1a, 2b/1b, 2а/1а, 4a/4d и другие циркулирующие рекомбинантные формы, которые имеют не только широкое географическое распространение, но и разную чувствительность к терапии. Для выявления этих вирусов необходимо проводить исследования нуклеотидных последовательностей удаленных участков генома вируса (core/E1 и N55) [8]. В результате проведенных исследований, выполненных в 2006—2011 гг., установлено, что среди взрослых пациентов, инфицированных ВГС, в республике преобладают подгенотипы 1b (53,8%), 3а (38,5%), 1а (5,1%), 4а (1,3%) и 4d (1,4%), что коррелирует с данными о распространенности вируса на территории Европы и России [9].

Целью данной работы является молекулярногенетическая характеристика ВГС у детей с ЗН, получающих массивную гемотрансфузию на фоне ПХТ, и определение возможных источников и путей его распространения. Следует отметить, что до настоящего времени в Беларуси такие исследования не проводились.
Материал и методы

В исследование включены 46 детей с ЗН, находившихся на лечении в РНПЦ ДОГиИ в период 2001 — 2013 гг. Среди обследованных было 10 (21,7±6,1%) девочек в возрасте от 3 мес до 24 лет и 36 (78,3±6,1%) мальчиков в возрасте от 1 мес до 29 лет. Жителями Республики Беларусь являлись 33 пациента (71,7±6,6%), 13 (28,3±6,6%) — из стран ближнего зарубежья (из Украины — 5, Казахстана — 5, Азербайджана— 1, Таджикистана — 1). У32 (69,6±6,8%) пациентов забор крови проводился многократно на протяжении 2001—2013 гг., у 14 (30,4±6,8%) — однократно. Критерием отбора являлся положительный тест на наличие в сыворотке/плазме крови РНК ВГС.

Серологические исследования для определения антител к ВГС методом иммуноферментного анализа (ИФА) проводили на тест-системах:
—    HCV version 3.0 «Hepatitis С virus Encoded Antigen (Recombinant HCr43, c200, c100-3, N55)» ИФА на микрочастицах «MEIA» с использованием анализатора Axsym («Abbott», Германия);
—    Antibody to hepatitis С virus (anti-HCV) электрохемилюминесцентный иммуноанализ «ECLIA» с использованием анализатора «Cobas 411».
ПЦР-диагностика. Выделение РНК из сыворотки/ плазмы крови выполняли с использованием «Комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-сорб», «РНК-преп» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Все манипуляции проводили согласно инструкциям производителя наборов.

Качественную и количественную ПЦР для выявления РНК ВГС выполняли с помощью тест-системы «Cobas Amplicor HCV Test» и «Cobas Amplicor HCV Monitor Test» («Roche», США) с применением автоматического ПЦР-анализатора «Cobas Amplicor».

Постановка ПЦР и секвенирующей ПЦР выполнена на амплификаторе «BioRad CFX-96» (США) согласно методике, описанной ранее [10].

ЛИТЕРАТУРА
1.    Alter M. J. // J. Gastroenterol.— 2007.— Vol. 13, № 17.— P. 2436—2441.
2.    Рейзис А. Р., Нурмухамедова Е. А. // Клиническая онкогематология.— М., 2001.— С. 539—553.
3.    Locasciulli A., Testa M., Valsecchi M. G., et al. // Blood.— 1997.— Vol. 90, № 9.— P. 3799—3805.
4.    Allander T, Gruber A., Naghavi M., et al. // Lancet.— 1995.— Vol. 345, № 8950.— P. 603—607.
5.    Esteban J. I., Gomez J., Martell M. // N. Engl. J. Med.— 1996.— Vol. 334, № 9.— P. 555—560.
6.    Khalifa A. S., Mitchell B. S., Watts D. M, et al. //Am. J. Trop. Med. Hyg.— 1993.— Vol. 49, № 3.— Р. 316—321.
7.    Smith D. B., Bukh J., Kuiken С, et al. //Hepatology.— 2014.— Vol. 59, № 1.— P. 318—327
8.    Avo A. P., Agua-Doce I., Andrade A., Padua E. // J. Med. Virol.— 2013.— Vol. 85, № 5.— P. 815—822.
9.    Гасич Е. Л., Еремин В. Ф., Сосинович С. В. и др. // Материалы VЕжегодного Всерос. конгресса по инфекционным болезням.— Москва, 2013.— С. 99.
10.    Гасич Е. Л., Еремин В. Ф., Сосинович С. В., Пинчук М.Г.// Здравоохранение.— 2010.— № 12.— С. 27—34.
11.    Katsoulidou A., Paraskevis D., Kalapothaki V., et al. // Nephrol. Dial. Transplant.— 1999.— Vol. 14, № 5.— P. 1188—1194.
12.    Januszkiewicz-Lewandowskayz D., Wysockiy J., Rembowska J., et al. // J. Hosp. Infect.— 2003.— Vol. 53, № 2.— P. 120—123.
13.    Stikleryte A., Griskeviciene J., Magnius L. O., et al. // J. Med. Virol.— 2006.— Vol. 78, № 11.— P. 1411—1422.
14.    Van Doorn L. J., Kleter G. E., Stuyver L., et al. // J. Gen. Virol.— 1995.— Vol. 76 (Pt 7).— P. 1871—1876.
15.    Knoll A., Helming M., Peters O., Jilg W. // Lab. Invest.— 2001.— Vol. 81, № 3.— P. 251—262.
16.    Visona K., Baez F., Taylor L., et al. // din. Diagn. Lab. Immunol.— 2002.— Vol. 9, № 3.— P. 622—626.
17.    Gonzalez-Candelas F, Wrobel B., Moya A. // BMC Biol.— 2013.— Vol. 11.— P. 76.

Поступила 08.08.14.

Адрес для корреспонденции:
Гасич Елена Леонидовна.
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии.
220114, г. Минск, ул. Филимонова, 23; сл. тел. (8-017) 268-04-42.

Ключевые слова: , , , ,
Автор(ы): Гасич Е. Л., Еремин В. Ф., Сосинович С. В., Домнич М. В., Черновецкий М. А., Лукьяненко И. Г., Гущина Л. М., Романова О. Н.
Медучреждение: РНПЦ эпидемиологии и микробиологии Минздрава Республики Беларусь, РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии Минздрава Республики Беларусь