Перейти к основному содержанию

Научно-практический рецензируемый ежемеcячный журнал. Орган Министерства здравоохранения Республики Беларусь
Входит в Перечень научных изданий Республики Беларусь для опубликования результатов диссертационных исследований по медицинским и биологическим наукам. Журнал включен в систему Российского научного цитирования.
Журнал издается с 1924 года.

Иммуносупрессивные свойства культивируемых эктомезенхимальных стволовых клеток обонятельного эпителия человека

It appears your Web browser is not configured to display PDF files. Download adobe Acrobat or click here to download the PDF file.

Click here to download the PDF file.

Целью работы явилась оценка иммуносупрессивных свойств культивируемых эктомезенхимальных стволовых клеток обонятельного эпителия (ЭМСК ОЭ) человека. Получены новые данные о способности ЭМСК ОЭ ингибировать митоген-индуцированную пролиферацию Т-клеток CD4+. Показано, что иммуносупрессивный эффект не связан с наличием растворимых факторов, продуцируемых стволовыми клетками, и для реализации иммуносупрессии требуется непосредственный контакт ЭМСК с лимфоцитами.

Установлено, что ЭМСК ОЭ характеризуются высокой экспрессией коингибиторных молекул CD273 и CD274 при отсутствии экспрессии молекул CD80 и CD86, что может являться одной из причин проявления иммуносупрессивного эффекта в отношении Т-клеток. Полученные результаты свидетельствуют о высоком потенциале использования ЭМСК ОЭ в клеточной терапии заболеваний, связанных с избыточным иммунным ответом.

В настоящее время активно изучаются перспективы применения стволовых клеток различного происхождения и полученных из них клеток-предшественников при лечении заболеваний человека.

Считается, что применение мезенхимальных стволовых клеток (МСК) является перспективным в клеточной терапии ряда инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также в предотвращении отторжения трансплантата. Результаты ряда доклинических и первых стадий клинических испытаний свидетельствуют об умеренной эффективности использования МСК различного происхождения в лечении рассеянного склероза, ревматоидного артрита, сахарного диабета 1-го типа, болезни Крона [1], туберкулеза со множественной и широкой лекарственной устойчивостью [2], HCV-ассоциированного цирроза печени [3] и др. Для применения в практической медицине постоянно проводится поиск новых источников биоматериала для получения МСК, совершенствуются методы их выделения, культивирования, накопления биомассы и контроля качества, интенсивно изучается влияние МСК на иммунную систему.

В настоящее время наиболее изучены иммуномодулирующие свойства МСК костного мозга и жировой ткани. МСК оказывают иммуносупрессивное действие на клетки иммунной системы. Влияние МСК в первую очередь проявляется на различных аспектах функционирования Т-клеточного звена иммунитета. Известно, что МСК ингибируют активацию, антигенспецифическую пролиферацию, образование цитотоксических Т-лимфоцитов, продукцию ИФН-у, ИЛ-4 и других важнейших цитокинов, оказывают проапоптотическое действие на клетки [4]. Более поздние исследования показали, что МСК проявляют иммуномодулирующую активность не только в отношении Т-клеток, но также подавляют функцию антигенпредставляющих клеток (дендритные клетки, В-клетки, макрофаги) и натуральных киллеров [S].

Иммуномодулирующее действие МСК реализуется через продукцию растворимых факторов роста, цитокинов, медиаторов ангиогенеза по принципу паракринного механизма. Так, МСК продуцируют трансформирующий фактор роста р (TGF-р), фактор роста гепатоцитов (HGF), простагландин Е2 (PGE2), растворимую форму протеина HLA-GS, гемоксигеназу (HO-1), индоламин-2, 3-диоксигеназу (IDO), индуцибельную синтазу оксида азота (iNOS) и др. [4—6].

Для применения МСК в клеточной терапии аутоиммунных заболеваний и отторжения трансплантата наиболее важной является способность МСК к иммуносупрессии. МСК, выделенные из различных источников (костный мозг, жировая ткань, плацента, периферическая кровь), схожи по своей способности ингибировать иммунный ответ [7].
Одной из доступных популяций тканеспецифичных стволовых клеток являются эктомезенхимальные стволовые клетки обонятельного эпителия (ЭМСК ОЭ) человека [8, 9].

Экспериментальные данные свидетельствуют, что трансплантации ЭМСК ОЭ индуцируют нейрогенез при повреждениях спинного мозга, гиппокампа, слуховых нервов, сетчатки глаза [10—12]. Перспективным направлением использования ЭМСК ОЭ в клеточной терапии может стать лечение дефектов эпителиального покрова верхних дыхательных путей. Полагают, что воздействие на процессы репарации, регенерации и сохранность тканей в очаге повреждения в значительной степени обусловлено выделением трансплантированными клетками нейротрофических факторов [10]. Тем не менее в литературе практически отсутствуют данные о механизмах индукции регенерации, спектре ростовых факторов, белков внеклеточного матрикса, которые синтезируются ЭМСК ОЭ и формируют благоприятное микроокружение для восстановления целостности тканей в зоне дефекта. Также остается открытым вопрос об иммунореактивности ЭМСК ОЭ и их способности модулировать локальную иммунную реакцию в области введения при трансплантации. Положительные эффекты клеточной терапии с применением ЭМСК ОЭ могут быть опосредованы иммуномодулирующими свойствами, характерными для других типов МСК. Однако способность ЭМСК ОЭ взаимодействовать с клетками иммунной системы и влиять на их функциональную активность изучена недостаточно.

Целью данной работы явилось изучение иммуносупрессивных свойств культивируемых ЭМСК ОЭ по отношению к митоген-индуцированной пролиферации лимфоцитов CD4+.

Материал и методы

Источники ткани ОЭ, приготовление культур ЭМСК ОЭ, условия культивирования. Образцы ткани ОЭ были получены из биопсийного материала слизистой среднего носового хода, направляемого на гистологическое исследование при проведении плановых хирургических вмешательств (БелМАПО, РНПЦ оториноларингологии) у пациентов с невоспалительными заболеваниями носовой полости и околоносовых пазух. Образцы ткани транспортировали и хранили при 4°С не более суток в питательной среде DMEM/F-12 (1:1), содержащей антибиотики: гентамицин (100 мкг/мл) и амфотерицин Б (10 мкг/мл). Первичные культуры и субкультуры ЭМСК ОЭ человека получали по ранее разработанной технологии [9]. Проводили оценку культур клеток ОЭ на соответствие паспортным данным (морфология — фибробластоподобная; жизнеспособность — не менее 95%; фенотип— не менее 90% CD90+, CD105+, нестин+, CD45- микробиологическая чистота).

Определение иммунофенотипа клеток методом проточной цитометрии. Фенотипирование клеток методом проточной цитометрии проводили по стандартной методике с использованием антител к молекулам СD90 (FITC), CD105 (PE), CD45 (PE-Cy7), нестину (FITC), СD40 (PE), CD80 (PE), CD86 (PE), CD273 (PE), CD274 (FITC), HLA-DR (FITC), ИЛ-10 (PE-CyS). Флюоресценцию регистрировали на проточном цитофлюориметре «FACSCalibur» («BD Biosciences», США). В процессе учета проб выделяли регион ЭМСК ОЭ по параметрам прямого и бокового светорассеяния, в котором регистрировали не менее 10 000 событий. Для анализа данных использовали программное обеспечение Weasel 3.0.2 («WEHI», Австралия).

Выделение мононуклеаров периферической крови (МПК). Для выделения мононуклеарных клеток 8— 10 мл гепаринизированной венозной крови дважды разводили добавлением стерильного DPBS. В пробирки для градиентного центрифугирования объемом 12 мл вносили стерильный градиент плотности Histopaque-1077 (р=1,077 г/см3), на который наслаивали разведенную кровь. Центрифугировали пробирки ^мин при 3000об./мин. Собирали кольцо мононуклеаров, клетки промывали 2 раза в DPBS и ресуспендировали в 1мл среды RPMI-1640 с 10% FBS.

Окрашивание МПК внутриклеточным флюоресцентным красителем 5(6)-карбоксифлюоресцеин диацетат N-сукцинимидил эфиром (CFSE). В суспензию МПК (в 1 мл среды RPMI-1640) добавляли CFSE в конечной концентрации S цМ. Инкубировали 10 мин в темноте при 37°С. Реакцию окрашивания останавливали добавлением охлажденного до 4°С DPBS, поместив пробирку на лед. Отмывали клетки дважды в холодном DPBS. Ресуспендировали осадок окрашенных МПК в полной ростовой среде RPMI-1640, доводили концентрацию до 1-10® кл/мл.

Сокультивирование ЭМСК ОЭ и МПК. При постановке эксперимента в различных комбинациях использовали 4 культуры ЭМСК ОЭ, полученные от разных доноров, которые соответствовали паспортным данным, и МПК, выделенные из крови 4 доноров. За сутки до начала совместного культивирования культуры ЭМСК ОЭ высевали в 4 мл ростовой среды DMEM/F-12 (1:1) с 10% FBS (полная ростовая среда) на 6-луночные планшеты в концентрации 20 тыс. кл./см2. На следующие сутки после образования монослоя ЭМСК ОЭ с конфлюентностью 70—80% удаляли из лунки 2 мл ростовой среды и вносили туда 2 мл суспензии МПК в полной ростовой среде RPMI-1640, свежеокрашенных CFSE (соотношение ЭМСК и МПК 1:10). В качестве контроля использовали культуры МПК без присутствия ЭМСК: к 2 мл МПК в полной ростовой среде RPMI-1640 добавляли 2 мл полной ростовой среды DMEM/F-12 (1:1). Во все лунки вносили неспецифический поликлональный митоген — фитогемаглютинин (ФГА) в конечной концентрации 2,S мкг/мл для индукции пролиферации МПК. Каждый вариант делали дважды. После внесения компонентов инкубировали планшет в течение 3 сут в CO2 инкубаторе (37°С, 5% CO2 и 95% влажность воздуха).

Культивирование МПК с кондиционированной культурами ЭМСК ОЭ ростовой средой. Культуры ЭМСК ОЭ высевали в полной ростовой среде DMEM/ F-12 (1:1) на пластиковые флаконы в концентрации 20 тыс. кл./см2, на 3-и сутки роста кондиционированную культурами среду использовали для постановки эксперимента. В 6-луночные планшеты в каждую лунку вносили по 2 мл суспензии МПК в полной ростовой среде RPMI-1640, свежеокрашенных CFSE, туда же добавляли по 2 мл кондиционированной стволовыми клетками ростовой среды DMEM/F-12 (1:1) и ФГА в конечной концентрации 2,5 мкг/мл. В качестве контроля использовали культуры МПК с добавлением свежей ростовой среды DMEM/F-12 (1:1) вместо кондиционированной. После внесения компонентов инкубировали планшет в течение 3 сут в CO2-инкубаторе (37°С, 5% CO2 и 95% влажность воздуха).

Оценка влияния ЭМСК на пролиферацию Т-лимфоцитов CD4+. Оценку индекса пролиферации и числа поделившихся клеток CD4+ оценивали по изменению интенсивности флюоресценции CFSE после окончания культивирования на 3-и сутки. Для анализа данных использовали программное обеспечение «ModFitLT». Гейтирование осуществляли следующим образом: на 2-мерной точечной цитограмме, построенной в координатах CD4 (APC) и 7-AAD, выделяли регион, содержащий жизнеспособные клетки CD4hi. Регион проецировали на гистограмму флюоресценции по каналу FL1 (CFSE). Вручную выставляли пик флюоресценции «родительской» популяции, рассчитывали число генераций пролиферирующих клеток и индекс пролиферации при помощи встроенных алгоритмов.

Методы статистической обработки данных. Значения показателей представлены в виде медианы и интерквартильного размаха в виде 25-й и 75-й процентилей. Для сравнения двух независимых выборок использовали U-критерий Манна—Уитни. В качестве критерия достоверности различий показателей принимали уровень значимости P<0,05.

 ЛИТЕРАТУРА
1.    Figueroa F. Е., Carrion F., Villanueva S., et al. // Biol. Res.— 2012,— Vol. 45.— P. 269—277;
2.    Skrahin A., Ahmed R. K., Ferrara G., et al. // Lancet Resp. Med.— 2014.— Vol. 2, № 2.— P. 108—122;
3.    Алейникова О. В., Лукашик С. П., Цыркунов В. М., и др. // Вести НАН.— 2010.— № 4.— С. S—13.
4.    Ghannam S., Bouffi C., Djouad F, et al. // Stem Cell Res. Ther.— 2010.— Vol. 1, № 1.— P. 2—17.
5.    Han Z., Jing Y., Zhang S., et al. // Cell Bioscience.— 2012.— Vol. 2.— P. 8.
6.    Devang M., Patel J., Shah F, et al. // Stem Cells Int.— 2013.— Vol. 23.— P. 15.
7.    Trapani M., Bassi G., Ricciardi M., et al. // Stem Cells Dev.— 2013.— Vol. 22, № 22.— P. 2990—3002.
8.    Tome M., Lindsay S. L., Riddell J. S., et al. // Stem Cells.— 2009.— Vol. 27, № 9.— P. 2196—2208.
9.    Антоневич Н. Г., Квачева 3. Б., Чекан В. Л., и др. // Клеточные культуры. Информацион. бюл.— 2012.— Вып. 28.— С. 27—36.
10.    Mackay-Sim A. // Archives Italiennes de Biologie.— 2010.— Vol. 148.— P. 47—58.
11.    Nivet N., Vignes M., Girard S. D., et al. //J. Clin. Invest.— 2011.— Vol. 121, № 7.— P. 2808—2820.
12.    Pandit S., Sullivan J. M., Egger V., et al. // Stem Cells.— 2011.— Vol. 29.— P. 670—677.
13.    Aggarwal S., Pittenger M. F. // Blood.— 2005.— Vol. 105.— P. 1815—1822.
14.    Oh J. Y., Kim M. K., Shin M. S., et al. // Stem Cells.— 2008.— Vol. 26, № 4.— P. 1047—1055.
15.    Ren G., Zhao X., Zhang L., et al. // J. Immunol.— 2010.— Vol. 184.— P. 2321—2328.
16.    Brooke G., Tong H., Levesque J., et al. //Stem Cells Dev.— 2008.— Vol. 17.— P. 929—940.
17.    Nauta A. J., Fibbe W. E. //Blood.— 2007.— Vol. 110.— P. 3499—3506.
18.    Freeman G. J., Sharpe A. H. //Nat. Immunol.— 2012.— Vol. 13, №2.— P. 113—115.
19.    Ni X., Jia Y. Q, Meng W. T, et al. // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi.— 2009.— Vol. 17, № 4.— P. 990—993.
20.    Sheng H., Wang Y, Jin Y., et al. // Cell Res. — 2008.— Vol. 18, № 8.— P. 846—857.
21.    Романова И. В., Гончаров А. Е., Титов Л. П. // Современные проблемы инфекционной патологии человека: Сб. науч. трудов.— 2013.— Вып. 6.— С. 240—245.
22.    Chatzigeorgiou A., Lyberi M., Chatzilymperis G., et al. // Biofactors.— 2009.— Vol. 35, № 6.— P. 474—483.
23.    Okazaki T, Honjo T. // Cell.— 2006.— Vol. 124, № 3.— P. 459—461.
24.    Ishida Y., Agata Y., Shibahara K., et al. //EMBO J.— 1992.— Vol. 1, № 1.— P. 3887—3895.
25.    Sheng H., Wang Y, Jin Y, et al. // Cell Res.— 2008.— Vol. 18, № 8.— P. 846—845.
26.    Zhang J., Yuan Z., Ren G., et al. // Cancer Res.— 2014.— Vol. 74, № S.— P. 1576—1587.
27.    Curti A., Trabanelli S., Salvestrini V., et al. //Blood.— 2009.— Vol. 113.— P. 2394—2401.

Поступила 08.07.14.

Адрес для корреспонденции:
Антоневич Наталья Георгиевна.
Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии.
220114, г. Минск, ул. Филимонова, 23; сл. тел. (8-017) 267-32-67.

  • Я только что вернулся с большого международного форума врачей и ученых, проходившего в Санкт-Петербурге. На нем обсуждались вопросы совершенствования диагностики и лечения хронического миелолейкоза. Мы теперь уже добились того, что продолжительность жизни таких больных увеличилась в четыре раза, в России уже живут, радуются жизни и трудятся люди, излеченные от этого тяжелого заболевания... На форуме наряду с отечественными клиницистами выступали гематологи из Хьюстона (США), Турина (Италия), Мангейма (Германия).
  • Я вспоминаю свои беседы с больными — преподавателями медицинского института, профессорами. Что говорить, трудно с ними работать! Трудно с ними говорить и действовать, как со всеми остальными пациентами...Что еще характерно для заболевшего врача в психологическом плане? Частенько такой пациент напрочь забывает не только действие препаратов, но и время их приема, хотя сам в своей жизни неоднократно назначал их.
  • При осмотре мы прежде всего также уделяем особое внимание кожному покрову. Нормальная кожа и изменения ее при различных заболеваниях довольно подробно представлены в учебниках и монографиях. Здесь мне хочется лишь привести некоторые сведения, которые будут интересны врачам различных специальностей и позволят понять, почему кожа претерпевает изменения. Известно, что кожа — это полноценный орган, который дополняет и дублирует функции различных внутренних органов. Она активно участвует в процессе дыхания, выделения, обмене веществ.
  • Я никогда не заканчиваю расспроса-беседы с больным без того, чтобы выяснить хотя бы ориентировочно состояние взаимоотношений в семье. Полипрагмазия — бич современной медицины, клиники внутренних болезней. На обходах часто приходится видеть, как больным назначают 13—16 препаратов, нередко с взаимоисключающими фармакологическими свойствами.
  • Изучив сотни диагностических ошибок, сотрудники нашего коллектива убедились, что в ходе диагностического процесса практические врачи нарушают даже самые элементарные правила логики. Например, они неправильно применяют методы аналогии, индукции, дедукции.
  • А в настоящее время мне самому приходилось и в поликлиниках, и в стационарах слышать такие «уважительные и милые» обращения медицинских работников (и даже студентов, которые берут со старших пример!!!), как «голубушка», «бабуля», «золотце», «милочка», «голубчик», «бабуся», «дедуся», «дедуля», «женщина», «человек», «старик», «папаша», «мамаша», «отец», «мать», «барышня», «мужик», «тетя», «дядя» и т. д. Многие из таких слов для больных обидны, полны презрения, как правило, задевают самолюбие пациентов и их родственников.
  • Он редко выслушивал до конца доклад о больном, часто сразу же задавал вопросы, уточняющие характер течения болезни, особенности жизни. Удивительно, что вслух он мог сказать: «Что-то тут мне не ясно. Чего-то не хватает в истории болезни». И начинал сам собирать и выяснять эти «недостающие звенья».
© Редакция журнала «Здравоохранение» - 1924 - 2014гг.
Разработка сайта - doktora.by - сайт для врачей Беларуси