Экспрессия цитокератина 19 при хроническом стеатогепатите и вирусном гепатите С

Цель. Изучить особенности экспрессии косвенного маркера репаративной регенерации (СК19) и корреляции его с показателями фиброгенеза и ангиогенеза при хроническом стеатогепатите и вирусном гепатите С.

Материал и методы. На базе Львовского областного патологоанатомического бюро проведен анализ 45 аутопсий. Они включали случаи алкогольного стеатогепатита, неалкогольного стеатогепатита и вирусного гепатита С на этапе цирротической трансформации. Использовали иммуногистохимические методы (маркеры СК19, —-SMA, CD34) с последующей морфометрической и статистической обработкой полученных данных.

Результаты. При вирусном гепатите С на этапе цирротической трансфомации наблюдается более высокая, чем при алкогольном и неалкогольном стеатогепатите, экспрессия маркера СК19 с преимущественной локализацией по периферии соединительнотканных септ.

Заключение. Прямая корреляция значений СК19 с показателями септального фиброгенеза и ангиогенеза свидетельствует о роли клеток с «билиарным фенотипом» в прогрессировании фиброза.

По данным ВОЗ, цирроз печени занимает 6-е место среди причин смертности в экономически развитых странах, все чаще развивается при прогрессирующем течении алкогольного стеатогепатита (АСГ), неалкогольного стеатогепатита (НАСГ) и вирусного гепатита С (ВГС) [1, 2]. Тканевая реорганизация при хронических заболеваниях печени зависит от взаимодействия процессов фиброгенеза, ангиогенеза и репаративной регенерации. В большинстве исследований основное внимание уделяется описанию гистотопографии соединительной ткани, иммунотипированию клеток фиброгенной популяции [3, 4], эндотелия [5, 6] и отдельных элементов экстрацеллюлярного матрикса [7]. Проявления репарации изучены меньше, что связано со сложностями выявления недифференцированных эпителиальных клеток [8]. Косвенным показателем репаративной регенерации можно считать увеличение количества клеток с так называемым билиарным фенотипом (включает экспрессию СК19), который характерен для предшественников зрелых гепатоцитов и холангиоцитов — гепатобилиарных клеток [9]. Исследования маркера СК19 проводили преимущественно у больных с холангиопатиями [10, 11], хотя известно, что повреждения дуктул и дуктулярная реакция наблюдаются и при других заболеваниях, в частности при вирусном гепатите С.

В отдельных работах изучались ассоциации фиброза с проявлениями ангиогенеза [12] и репарации, анализ которых проводился, как правило, в группе больных, имеющих одну нозологическую форму заболеваний [13, 14].

Целью настоящего исследования было изучение особенностей экспрессии маркера СК19 и корреляции его с показателями фиброгенеза и ангиогенеза при хроническом стеатогепатите и ВГС.

Материал и методы

Изучили материалы 45 аутопсий, проведенных на базе Львовского областного патологоанатомического бюро. В группу исследования включили случаи АСГ, НАСГ и ВГС на этапе цирротической трансформации. Диагноз АСГ подтверждался данными анамнеза при длительном злоупотреблении алкоголем (более 210 г в неделю или 30г в день) и морфологическими проявлениями алкогольной болезни — кардиомиопатии, хронического панкреатита, алкогольной энцефалопатии и типичных изменений печени. Вирусный генез считался достоверным при наличии данных о положительных маркерах гепатита С (RNA HCV) и морфологических признаков вирусного поражения (критерии METAVIR) [15]. Верификация диагноза неалкогольного стеатогепатита включала выявление признаков метаболического синдрома и соответствующих изменений печени (критерии Brunt) [16]. Степень фиброза оценивали при помощи шкалы METAVIR.

Изучение особенностей морфогенеза фиброза и репарации проводили на основе иммуногистохимического исследования с последующим морфометрическим анализом. Для иммуногистохимического исследования срезы толщиной 4— 6 мкм наносили на специальные адгезивные предметные стекла SuperFrostPlus, затем депарафинировали соответственно принятым стандартам, после чего использовали первичные антитела.

Для определения активированных печеночных звездчатых клеток/фибробластов использовали моноклональные антитела к а-изоформе гладкомышечного актина (а-SMA) Моа-Hu Alpha Smooth Muscle Actin, Clone 1A4 («DakoCytomation», Дания). Иммуногистохимическое исследование эндотелиальных клеток проводили с использованием моноклональных антител Moa-Hu CD34 Classll, Clone QBEnd 10 («DakoCytomation», Дания). Клетки с «билиарным фенотипом» маркировали при помощи моноклональных антител Moa-Hu Cytokeratin 19, Clone RCK108 («DakoCytomation», Дания). Следующий этап иммуногистохимического исследования проводили с использованием системы визуализации «EnVision» («DakoCytomation», Дания). Идентификацию реакции осуществляли при помощи хромогена (DAB («DakoCytomation», Дания) под контролем микроскопа с проявлением в виде темно-коричневого окрашивания спефических структур в зависимости от маркера (ядерная, цитоплазматическая, мембранная реакции).
Срезы, окрашенные гистохимическими и иммуногистохимическими методами, использовали для морфометрического анализа с определением относительной площади соответствующих структур (коллагеновые волокна, клетки). Для этого в каждом случае исследовали 20 фотографий ткани печени на малом увеличении (х100) и 20 фотографий на большом увеличении (х400). Крупные сосуды и желчные протоки исключали из исследования. Анализ изображений проводили при помощи лицензионной программы «lmagе-ProPlus» (Version 6). Относительная площадь, которую занимали клетки с экспрессией изучаемых маркеров, определялась в 3 компартментах: общем (G), септальном (S) и лобулярном (P).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ «STATlSTICA 6.0» («Statsoft», США). Рассчитывали среднее значение (М), стандартное квадратичное отклонение (s). Перед выбором метода сравнения параметрических показателей в разных группах осуществляли проверку на нормальность распределения (критерий Шапиро—Уилка). Для выявления статистической значимости разницы между параметрическими показателями использовали дисперсионный анализ (ANOVA) с апостериорным попарным сравнением групп при помощи критерия наименьшей значимой разницы (LSD-test). Для оценки корреляционных связей использовали критерий Пирсона. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.

ЛИТЕРАТУРА
1.Schuppan D., Afdhal N. Н.//Lancet.— 2008.— Vol. 371, № 8.— P. 838—851.
2.Williams R. // Hepatology.— 2006.— Vol. 44.— P. 521—526.
3.Туманский В. А., Шебеко Ю. А., Гооменко Е. А., Фень С. В. // Патолог1я. — 2012.— № 2.— С. 33—35.
4.Tomanovic N. R., Borivic I. V., Brasanac D. С., et al. // J. Gastrointest. Liver Dis.— 2009.— Vol. 18, № 2.— P. 163—167.
5.Chen J.-A, Shi M., Li J.-Q., Qian С.-N. //Hepatol. Int.— 2010.№ 4.— P. 537—547.
6.Coulon S., Heindryckx F., Geerts A., et al.// Liver Int.— 2011.Vol. 31, №2.— P. 146—162.
7.Wells R. G. // Clin. Liver Dis.— 2008.— Vol. 12, № 4.— P. 759—764.
8.Roskams T. A., Theise N. D., Balabaud C., et al. // Hepatology.— 2004.— Vol. 39.— P. 1739—1745.
9.Zhang L., Theise N., Chua M., Reid L. M. //Hepatology.— 2008.Vol. 48, № 5.— P. 1598—1607.
10.Glaser S. S., Gaudio E., Miller T., et al. //Expert Rev. Mol. Med.— 2009.— Vol. 30.— P. 421—435.
11.Priester S., Wise C., Glaser S. S.// World J. Gastroenterol. Pathophysiol.— 2010.— Vol. 16, № 2.— P. 30—37.
12.Paternostro C., David E., Novo E., Parola M. // World J. Gastroenterol.— 2010.— Vol. 16, №21.— P. 281—288.
13.Chen Y, Li J.-G, Lang S., et al. // World J. Gastroenterol.— 2006.— Vol. 12, № 9.— P. 1443—1446.
14.Syn W, Jung Y, Omenetti A., et al.// Gastroenterol.— 2009.Vol. 137, №4.— P. 1478—1488.
15.Bedossa P., Poynard T. // Hepatology.— 1996.— Vol. 24.— P. 289—293.
16.Brunt E. M., Tiniakos D. G. // World J. Gastroenterol.— 2010.Vol. 16, Iss. 42.— P. 5286—5296.
17.Godoy P., Hengstler J. G., Ilkavets I., et al. // Hepatology.— 2009.— Vol. 49, № 6.— P. 2031—2043.

Поступила 12.02.14.

Адрес для корреспонденции:
Гаврилюк Елена Михайловна.
Львовский национальный медицинский университет им. Д. Галицкого.
79010, г. Львов, ул. Пекарская, 69; сл. тел. (0322) 76-93-71.

Ключевые слова: , , ,
Автор(ы): Гаврилюк Е. М.
Медучреждение: Львовский национальный медицинский университет им. Д. Галицкого